大家好，我是晶美小编又来和大家分享啦，今天我们就来说一说双抗体夹心法的注意事项。

以下是注意事项：

1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。

2.包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。

3.对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。

4.用最适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为最适包被浓度。一般总是要选择那个OD值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的OD值有明显差别。

5.抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加完全且均匀。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH 7.2-7.4 PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10 ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml较为合适，但均应通过滴定。