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ELISA实验中的"花板"现象解读
文章来源:江苏晶美生物科技有限公司   添加时间:2020/8/12 13:58:16 点击率:119

在ELISA实验过程中时常会出现我们时常说的"花板"现象,这种现象影响检验结果的正确判读,对工作造成一定的不利影响。

一旦出现“花板”,实验结果必须放弃,不仅浪费物料和时间,而且还会出现样本量缺少、交叉污染、报告延迟等一系列问题。

所谓“花板”,就是空白、阴性、阳性对照及室内质控孔结果正常,而标本孔的OD值却偏高,弱阳性结果较多。

“花板”现象的出现,往往会给实验者判读结果带来麻烦。现对“花板”现象进行了分析和总结,认为花板原因大多在样品,解决办法主要在洗涤。孵育和显色过程也会导致。


一、 花板原因大多在样品

“花板之所以空白、对照及质控结果正常而标本孔异常,是因为样品本身的原因,大部分或全部标本孔的OD值偏高,很可能是因为样品中某些共有的物质非特异性的吸附于固相载体,而在实验的过程中未被除去。 

待测血清中混有红细胞或纤维蛋白原 这两种物质易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净。实验中,在较高的离心转速(3000 /min)和较长的离心时间(>10 min)之下,血液标本被充分地离心分离之后,使红细胞和纤维蛋白充分沉淀,可以在加样时避免加入红细胞和纤维蛋白,避免这两种干扰物质对实验结果的影响,就可避免“花板”情况。 

二、 解决办法主要在洗涤

聚苯乙烯因其具有较强的吸附蛋白质的性能而被广泛用于ELISA实验的固相载体,聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,因此需要通过洗涤清除在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却决定着实验的成败。

血清中存在红细胞或纤维蛋白原,可以在加样前离心时得到控制,同样也可以通过适当增加洗涤次数和浸泡时间减轻或避免对实验结果的影响。同样,对于血液存在的非特异性的IgG很难在加样时将其去除,那么解决的最佳时机就是洗涤过程。 

为了避免“花板”问题的出现,降低检测的假阳性率,获得更理想的实验结果,在检测过程中应采取下列措施:

在选择ELISA试剂盒时,应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便、省时的。

在所有标本进行检测的过程中,所用的仪器及加样过程都处于正常状态的情况下,步骤均按照各种试剂说明书的要求去做,排除实验所用仪器和操作步骤对实验结果的影响。

样品应严格按照规定,无溶血,无凝血,足量。单个的溶血样品虽不致造成“花板”,但血红蛋白中的血红素基团,具有类过氧化物的活性,在以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)为标记酶的ELISA测定中,易在孵育过程中吸附于固相,从而与后面加入的底物反应显色,从而造成假阳性。

血液标本应置于室温下1-2h,使血液凝固收缩,然后离心检测或让血液过夜后再检测。这样才能使得血液充分收缩,让标本中的非特异性物质所致的假阳性率降至最低。检测之前,加大离心转速,尽量延长时间,使血细胞和纤维蛋白充分沉淀,让血细胞与血清彻底分离。

对于血清中存在的红细胞或纤维蛋白原,可以在加样前离心时得到控制,同样也可以通过适当增加洗涤次数和浸泡时间来进一步减轻或避免对实验结果的影响。同样,对于血液存在的非特异性的IgG,增加洗涤次数和延长浸泡时间也同样有效。

加样时不能加入红细胞或纤维蛋白,要按照操作说明书去做。加样时应尽可能的垂直加样,并加在包被孔的底部(提示:勿应用力过度破坏底部包被物质),不可加在孔的上部及外部。

封板温育时,各孔一定要封严,防止阳性标本的液体蒸发,产生周边现象从而导致“花板”的出现。

孵育时间过长,增加了固相载体吸附非特异性蛋白的可能性,也会造成“花板”。因此,除把握孵育时间外,在加样过程中也应严格控制时间,标本较多时可分批操作。

手工洗板时应注意液体被溅出或孔与孔之间的液体溢出,连成整体液面后产生“花板”。用洗板机洗板时应防止针口有纤维蛋白或异物,这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。

洗液的温度也会影响洗板的干净程度,尤其是冬天温度过低时容易出现“花板”问题。洗液要注满孔,孔壁洗涤不干净也易造成“花板”现象。(提示:洗液要尽量新鲜配制,放置时间过长易产生絮状物或浑浊,造成堵孔或花板)。

酶标仪应安置在避光条件下,比色前应提前15-30分钟开机预热,这样测定结果会更稳定。为防止显色的加深或减弱,显色时间完成后应立即滴加终止液(避免气泡产生),并在10分钟内完成比色。酶标板从水浴箱取出后应擦净孔底水滴,若有水滴或纸屑残留在孔底,会造成酶标仪读数错误,误判定为“花板”。

有些厂家的试剂显色液不稳定,使用前容易变蓝,如在实验前不仔细检查,很容易导致“花板”现象的发生,这也提醒实验者应使用新鲜的显色液,最大程度的保证实验的准确性。

通过上述措施,并且严格按照相关实验SOP操作实验,可以有效避免“花板”现象的出现。当然,好的操作规范也需要好的产品来搭配。实验已不易,所以用点好的ELISA试剂盒很有必要!

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